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日立 F - 4500 型荧光分光光度计的调试及应用
发布时间:2018-11-08 点击次数:50次

荧光法因其具有灵敏度高、选择性强、用样量少、方法简便等优点,现已广泛应用于食品检验、化 学、医学、药物分析、冶金、生命科学和环境科学等各个领域。简单介绍了日立 F - 4500 型荧光分光光度计 的基本结构,对其波长扫描的调试方法做了详细介绍。

荧光分光光度计是一种用来扫描液相荧光标记 物所发出的荧光光谱的常用仪器。它不仅能提供发 射光谱、激发光谱,而且能提供荧光强度、量子产率、 荧光寿命以及荧光偏振等多种物理参数,可以从各 个角度反映分子的成键以及结构情况。通过对这些 参数的测定,不但可以对样品做定量分析,而且还 可以推断出分子在不同环境下的构象变化,从而阐 明分子结构与功能之间的关系。荧光光谱法有诸多 优点,如灵敏度高、选择性强、用样量少、方法简便、 工作曲线线形范围宽等,所以荧光分光光度计可以 广泛应用于食品检验、地理、化学、医学、药物分析、 冶金、生命科学和环境科学等各个领域[1 - 12]。日立 F - 4500 型荧光分光光度计的激发波长扫描范围一 般是 200nm ~ 900nm,发射波长扫描范围是 200nm ~ 900nm,可用于液体、固体样品的光谱扫描。该仪器 采用的分析方法一般包括波长扫描、时间扫描、光度 值法、三维扫描。现就波长扫描方法的调试做一 介绍。 1 仪器的基本结构 ( 1) 激发光源: 高压汞蒸气灯或者氙弧灯,其中 氙弧灯能发射出强度较大的连续光谱,波长范围在 300nm ~ 400nm ,且强度几乎相等,所以常用氙弧灯 作激发光源。 ( 2) 激发单色器: 位于光源和样品室之间,又叫 第一单色器,用于筛选出特定的激发光谱。 ( 3) 发射单色器: 位于样品室和检测器之间,也 叫第二单色器,常用光栅作为单色器。用于筛选出 特定的发射光谱。 ( 4) 样品室: 通常情况下,液体样品用石英池, 粉末或片状样品用固体样品架。测量液体时,让光 源与检测器成直角; 测量固体时,让光源与检测器成 锐角。 ( 5) 检测器: 一般用光电管或光电倍增管作检测器。其作用是将光信号放大并转为电信号。 2 开机前的准备 ( 1) 实验室温度应保持在 15℃ ~ 30℃ 之间,湿 度应保持在 45% ~ 70% 之间。 ( 2) 确认样品室内无样品,安装好所使用的样 品池架,关上样品室盖。 ( 3) 准备好四面透明的石英比色皿。 3 调试方法 ( 1) 打开电脑主机电源。 ( 2) 打开电源开关( POWER→ON) ,等待仪器风 扇运转正常。 ( 3) 间隔 10 秒后,按下氙灯的点灯按钮( LAMR START) ,令黄灯亮起( 注意按钮时间不能超过 20 秒) 。如果使用外接激发光源,不用操作该步骤。 ( 4) 当黄灯亮起不熄灭时,等待 5 ~ 10 分钟,打 开主板电源( MAIN→ON) 。 ( 5) 点击 FL solutions 图标,打开仪器工作程序 窗口,等待仪器自检。 仪器自检完毕后,开机工作完成,然后进行分析 方法的编辑与样品测试。 4 分析步骤 所谓波长的扫描,就是固定激发波长扫描荧光 强度随发射波长的变化关系,或者是固定发射波长 扫描荧光强度随激发波长的变化关系。其分析方法 ( Method) 包括 6 个选项,可以根据实验要求具体选 择。 点击右侧快捷栏的“Method”后,立即显示了分 析方法( Analysis Method) 的 5 个重叠界面,分别为 General( 常规) ,Instrument( 仪器条件) ,Monitor ( 模 拟监 视) ,Processing ( 处 理 方 法) ,Report ( 报 告 格式) 。 4. 1 “常规 ( Genernal) ”选项的编辑 Measurement 选择 Wavelength scan; Operator 输 入操作者姓名; Instrument 自动给出,Sampling 中输 入样品名称; Comments 输入对样品的简要说明,也 可不输入; Load 调用已经存入的条件,一般不用; Save 保存现在的条件或 Save As 将现在的条件另 存为。 4. 2 “仪器条件( Instrument) ”选项的编辑 Scan mode( 扫描方式) 有两种: Emission( 发射) 和 Excitation ( 激 发) ,Data mode ( 数 据 方 式) 选 择 Fluorescence( 荧光采集) 。EX WL 输入激发波长,EM Start WL 输入发射光谱扫描的开始波长,EM End WL 输入发射光谱扫描的结束波长,EM WL 输 入发射波长,EX Start WL 输入激发光谱扫描 的开始波长,EX End WL 输入激发光谱扫描的结束 波长,Scan speed 选择扫描速度,一般选择 240,Delay 选 0,EX 和 EM 分别为激发单元和发射单元的狭 缝,一般情况下选 5. 0 即可。PMT Voltage 为光电管 电压选择,有 400V,700V,950V 三个值,一般选择 700V。Response 为响应速度,一般选择 2. 0s,速度 快则峰形分辨率高,但噪音大,速度慢则反之。选中 Shutter control,Replicates 设为 1。 如果是已知激发波长和发射波长的样 品,按照上述方法输入测试条件即可。实际扫描时, 若激发波长为 λex ,则扫描范围一般为 λex + 20 ~ 2λex - 20 ,并且 2λex - 20 ≤ 900nm ; 若发射 波长为 λem ,则扫描范围一般为 λem /2 + 20 ~ λem - 20,并且 λem - 20 ≤ 900nm 。 如果是未知条件的样品可先选择发射( Emission) 模式,在 EX WL 处输入一个范围在 200nm ~ 300nm 内的激发波长,先预扫描发射光谱,记录下峰 值波长 λem ; 然后选择激发( Excitation) 模式,在 EM WL 处填入 λem 的值,扫描激发光谱,记录下激发光 谱的峰值波长 λex ; 然后用该值 λex 再一次在发射模 式下扫描发射光谱,重复上面的过程,直到所得到的 两个峰值波长不发生变化为止。这时得到的两个峰 值波长即为激发波长和发射波长。 4. 3 “模拟监视( Monitor) ”选项的编辑 Y Axis Max 的数值在样品预扫描后仪器自动赋 值,Y Axis Min 需要根据具体情况手动赋值。Open data processing window after data acquisition( 测量后 打开数据处理窗口) 选中后测量结果可自动保存, 一般选中。Print report after data acquisition 选中后 数据采集后自动打印,一般不选。Overlay( 重叠光 谱图) 选中后扫描时可将光谱图重叠在监视画面 上,但重复扫描不可设定,一般选中。实际扫描时, 该选项一般不用编辑。 4. 4 “处理方法( Processing) ”选项的编辑 此界面主要是对已经测定的图谱根据用户的要 求进行选择处理。 CAT( 平均化) ,选中时仪器会对重复测定的图 谱进行平均处理。 Processing( 处理方法的选择) ,共有 4 种处理方 法: Savitsky - Golay Smooth ( Savitsky - Golay 平 滑) ,Mean Smooth ( 平均平滑) ,Median Smooth ( 中间平滑) ,Derivative ( 微分求导) 。Peak Finding ( 峰 检 出) 共 有 3 项 内 容,Integration ( 检 出 方 法) 、 Threshold( 阈值) 和 Sensitivity( 灵敏度) 。其中 Integration 包 括 Rectangnlar ( 矩 形) 、Trapezoid ( 斜 方 形) 和 Romberg ( 龙伯格) 三种检出方法; Threshold 可决定信号峰的取舍,赋值范围为 0. 001 ~ 1000,小 于赋值的峰可以显示但不打印结果; Sensitivity 可改 变放大器的放大倍数。一般设置为 1。 4. 5 “报告格式( Report) ”选项的编辑 报告格 式 共 有 Output ( 输 出) 、Orientation ( 方 位) 、Pintable items( 打印选项) 和 Printer Font( 打印 机字形) 。其中 Output 包括 3 种可选格式: Print Report 打印报告、Use Microsoft Excel 将数据变换为微 软 Excel 格式、Use print generator sheet 利用变换器 ( 附选件) 打印图表; 选中 Include data、Include method、Include graph、Include data listing、Include peak table、Peak WL /Peak data、Start WL /End WL、Valley WL /Valley data、Peak Area。 该选项需要注意的是,Date 输入光谱横坐标的 数据点间隔一般为 0. 2,Date start 和 Data end 的数 据一般要与 Instrument 中设置的 EM( Ex) Start WL 和 EM( EX) End WL 一致,否则激发光谱或发射光 谱扫描完后输出的文本( txt) 文件的波长范围与图 谱文件( 扩展名为 FDS) 的波长不一致,而无法用其 他软件对结果进行处理分析。这一点在操作时容易 被忽视,所以要注意。 4. 6 运行仪器测量样品 将待测溶液倒入石英比色皿,用吸水纸将石英 比色皿外侧的溶液拭去,打开样品室盖,将石英比 色皿放入样品室中,盖好盖子。点击右侧的 Measure 按钮,仪器开始测量。测量完成后,打开数据处理 窗口,点 File 菜单中的 Save as 保存图谱文件,选择 路径并 设 置 文 件 名 后 保 存 图 谱 文 件 ( 扩 展 名 为 FDS) ,用同样的方法保存一个与图谱文件相同文件 名的文本( 扩展名为 txt) 文件,将设置的参数保存 下来。 4. 7 关机顺序 将石英比色皿从样品室中拿出并清洗干净。退 出所有程序,关闭电脑。关闭光度计主开关( MAIN →OFF) 。当电源开关关闭后 5 秒钟,再次接通 10 分钟,让风扇工作,使灯室散热,最后关闭电源开 关( POWER→OFF) 。 5 结语 荧光分光光度计属于大型精密仪器,价格昂贵, 故障较难维修并且费用较高。所以,应严格按照正 确的顺序操作,并定期进行维护和保养,否则将影 响激发光源的使用寿命,进而影响到整台仪器的使 用寿命。目前荧光分光光度计的应用范围越来越 广,所以应操作熟练荧光分光光度计,以提高其利 用率。


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