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用于酶学参考测量的分光光度计的性能评价
发布时间:2018-11-08 点击次数:51次

分光光度计是参考测量实验室的关键设备之一,评价分光光度计的性能是否符合要求对酶学参考测量工作的 有效开展非常重要。方法 分光光度计基本性能指标需经北京市海淀区计量检测所检定。本实验室参考美国临床实验室 标准化协会( Clinical and Laboratory Standards Institute,CLSI) EP 系列文件,结合参考实验室特点,利用以 AgilentCary100 分光 光度计为主要设备的参考测量检测系统,按照国际临床化学 和实验室医学联合会 ( International Federation of Clinical Chemistry and laboratory medicine,IFCC) 公布的一级参考测量程序( 37℃ ) 对丙氨酸氨基转移酶( ALT) 、天冬氨酸氨基转移酶 ( AST) 、γ-谷氨酰转肽酶( GGT) 进行测定,评价系统的基本性能参数、精密度、正确度、分析测量范围。结果 AgilentCary100 紫外可见分光光度计的基本性能指标经海淀区计量检测所检定,结果示透射比示值误差、透射比重复性、波长示值误差、波 长重复性、噪声、杂散光均在允许误差范围内。ALT、AST、GGT 三种酶测定的总变异系数( CV) 均小于 1% 。测定有证参考物 质( ERM) 和参考实验室外部质量评价计划( RELA) 样本检测结果的均值和相对偏倚均在允许的范围内。ALT、AST、GGT 三 种酶的分析测量范围上限分别为 240U /L,330U /L,310U /L,均接近或高于 IFCC 公布的参考方法的上限。结论AgilentCary100 分光光度计的性能条件符合酶学参考测量的要求,测定结果准确、可靠。

作为参考测量系统的重要组成部分,分光 光 度 计的性能直接 影 响 检 测 结 果 的 准 确 性 和 可 靠 性,同 时,参考测量领域对仪器设备的稳定性、准确性提出 了更高的要求,因此,需要对分光光度计的性能进行 系统评价,保证参考测量结果的科学、准确。丙氨酸 氨基转移酶( ALT) 、天冬氨酸氨基转移酶( AST) 、γ- 谷氨酰转 肽 酶 ( GGT) [1] 是酶学参考测量的常规项 目,也是肝功能检测的基 本项目。 作 为 通 过 ISO17025 认可的参考测量 实 验 室,本 实 验 室 已 建 立 包括天门冬氨酸氨基转移酶在内的参考方法[2],且 多年来应用 Thermo Evolution 300 分光光度计为关键 测量设备之一参加 RELA 及卫生部室间质评成绩均 合格[3],证明本实验室整个参考测量系统符合参考 测量工作的 要 求。为更好的开展参考测量工作,本 实验 室 引 进 了 Agilent Cary100 紫 外 可 见 分 光 光 度 计,作为酶学参考测量的关键设备之一,在启用新的 分光光度计前 需 要 经 过 性 能 评 价 试 验,证 明 此 分 光 光度计性能指标符合参考测量要求。 材料和方法 1 材料 1. 1 仪器 美国 AgilentCary100 紫外可见分光 光 度 计; 美 国 Fluke 1521 点 式 温 度 计 ( 精 度 为 0. 001℃ ) ; 德国 Eppendorf reference 型 移 液 器; 德 国 Sartorius 电子天平( 精度为 0. 01mg、0. 1mg 各 1 台) ; 美国 Hamilton Microlab500 稀释配液仪; 瑞士梅特勒- 托利 多 SevenMulti 型; 美 国 Thermo Haake B12 型 水 浴锅。 1. 2 试剂 三羟 甲 基 氨 基 甲 烷、L-丙 氨 酸、α- 酮戊二 酸、还 原 型 β-烟 酰 胺 腺 嘌 呤 二 核 苷 酸 二 钠 盐、吡哆醛-5 磷酸、氯 化 钠、叠 氮 钠、丙 酮 酸、L-天 门 冬氨酸、氢氧化钠、草酰乙酸、N-甘氨酰甘氨酸,L-γ- 谷氨 酰-3-羧 基-4-硝 基 苯 胺、单 氨 酸 盐、一 水 化 合 物、乳酸脱氢 酶、牛 血 清 白 蛋 白 均 购 自 Sigma 公 司; 苹果酸脱氢酶来源于 Roche 公司。实验用水为去离 子水,电导率 > 18 兆欧。 1. 3 样 本 精 密 度 试 验 样 本 来 自 于 Roche 公 司生产的多项生化校准品( c. f. a. s,批号: 171651) , 以及往年的 RELA 样本。正确度试验样本来自于欧 共体参考物质与测量研究所制备的有证标准物质 ( ERM-AD454k /AD457 /AD452) ,以及 2016 年 RELA 样本。分析测量范围试验样本采用人新鲜血清,高 值样本采用添加法制备。 2 方法 1. 3 基本性能指标评价 AgilentCary100 紫外 可见分光光度计基本性能由北京市海淀区计量检测 所按照 JJG178-2007《紫外、可见、近红外分光光度计 检定规程》对 波 长、透 射 比、噪 声、杂散光等进行检 定。在 340nm 处,带 宽 2nm,每 秒 测 定 一 次 吸 光 度, 共连 续 监 测 2 小 时,计 算 吸 光 度 随 时 间 的 变 化 率。 参考美国临床实验室标准化协会( CLSI) EP15-A2 文 件[4],选择 c. f. a. s 样本,以及往年留存的室间质评 样本,按照要求进行复溶,对 ALT、AST、GGT 三个项 目按照 IFCC 公布的参考测量程序连续检测 5 天,每 天 1 批,每个样本重复 4 次。对数据进行统计分析。 3 正确度验证实验 参考 CLSI 颁 布 的 EP15-A2 文 件,分 别 对 ERM 和 RELA 2016 样本进行检测: ( 1 ) 检 测 ERM-AD454k /AD457 /AD452,根 据 ERM 体积特点,共检测 3 ~ 8 次,计算均值,判断其是 否在标示 值 不 确 定 度 范 围 内; ( 2 ) 测 定 RELA 2016 A、B 样本,每批 2 次重复,测定 5 天,计算均值,并与 RELA 公布的所有实验室均值比较,观察其是否在给 定的置信区间内。 4 分析测量范围评价 参考 CLSI EP6-A[5] 文 件,选 择 覆 盖 IFCC 文 件 提供线性范 围 的 20% ~ 30% 的 高( H) 、低( L) 浓 度 水平混合血清,低浓度样本为人新鲜血清,高浓度样 本为人新鲜血 清 添 加 室 间 质 评 样 本 制 得,按 比 例 配 制成 6 个系列浓度样本,每个样本重复检测 4 次,将 所得数据进行多项式回归统计。 5 统计学方法 采用 SPSS 17. 0 软件系统对实验结果进行均值 ± 标准差( x ± s) 、变 异 系 数 ( CV) 以及回归等相关 分析。 结 果 1 基本性能指标结果 基本性能指标结果见表 1。 表 1 Agilent Cary100 紫外可见分光光度计检定结果 项目 检测结果 允许误差 波长示值误差( nm) 0. 6 ± 6. 0 波长重复性( nm) 0. 0 ≤3. 0 透射比示值误差( % ) - 1. 5 ± 2. 0 透射比重复性( % ) 0. 1 ≤1. 0 杂散光( % ) 0. 1 ≤2. 0 噪声 0% 线( % ) 0. 0 ≤0. 5 100% 线( % ) 0. 0 ≤1. 0 吸光度稳定性( abs/ h) - 0. 000124 ± 0. 0003 2 精密度评价结果 ALT、AST、GGT 总不精密度指标均小于 1% ,见 表 2。

3 正确度评价结果 按 照 IFCC 公 布 的 参 考 测 量 程 序 检 测 ERMAD454k /AD457 /AD452,结 果 均 在 有 证 标 准 物 质 的 标示值不确 定 度 范 围 内。测 定 RELA 2016 A、B 样 本,其均值均在给定的置信区间内。

4 分析测量范围评价结果 对 ALT、AST、GGT 检测结果进行线性模型回归 分析,其回归系数 R2 > 0. 999,其在建立的分析测量 范围内成线性,见图 1、图 2、图 3。ALT、AST、GGT 分 析测量范围上限分别为 240U /L,330U /L,310U /L, 均接近或高于 IFCC 公布的参考测量程序的检测上 限,线性回归模型及回归方程见。

参考测量程序和参考实验室处于溯源链的上 游[6-8],参考测量工作对试剂、仪器、人员等各方面的 要求都较 高,我国酶学参考测量网络已经建立[9]。 作为酶学参考 测 量 工 作 的 关 键 设 备 之 一,分 光 光 度 计的性 能 至 关 重 要。本实验通过检测 ALT、AST、 GGT 这三项已 通 过 CNAS 认可的参考测量项目,同 时从多角度全面评价 Agilent Cary100 分光光度计的 性能,评价 结 果 准 确、可 靠。在 精 密 度 评 价 中,GGT 项目检测 c. f. a. s 总 变 异 系 数 小 于 检 测 往 年 RELA 样本的变异系数,而前者的浓度较低,考虑可能的原 因为此实验中 所 用 的 RELA 样 本 存 放 过 久,样 本 本 身的不稳定性较大,导致其测定结果 CV 较大。在精 密度评价结果中,虽然此实验各项目检测总 CV 均小 于 1% ,而本实验室质量目标为总 CV 小于 2% ,,这 是考虑到淀粉 酶、葡萄糖等变异较大的项目综合自 身检测能力而 制 定 的,这也与国内其他实验室的实 验室质量控制目标一致[10]。与 Thermo Evolution 300 分光光度 计 相 比[11],Agilent Cary100 分 光 光 度 计 对 温度控制更加稳定,受外界环境温度影响小,批间重 复性好,这主要是由于加热模块的工作原理不同, Agilent Cary100 分光光度计采用水循环加热,Thermo Evolution 300 分光光度计采用半导体模块加热,前者 温度控制更稳定,但也存在更改温度设置后,温度变 化响应速度慢 的 缺 点,需要试验人员对试验环节的 准确控制,才能保证参考测量程序的有效执行。同 时,Agilent Cary100 分光光度计可同时进行多杯检 测,且重复性较好,利于提高试验效率。 Agilent Cary100 紫外可 见 分 光 光 度 计 的 性 能 条 件符合酶学参考测量的要求,测定结果准确、可靠。


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